立式高壓蒸汽滅菌器在微生物實驗室污染廢棄物滅菌處理中的實驗研究

更新時間：2025-10-21 點擊次數(shù)：184

微生物實驗室污染廢棄物（包括培養(yǎng)基殘渣、菌液離心管、接種環(huán)、實驗耗材等）常攜帶大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、結(jié)核分枝桿菌等致病菌，部分還含耐熱芽孢（如枯草芽孢桿菌黑色變種），若滅菌不透徹，不僅會造成實驗室交叉污染，還可能通過氣溶膠傳播引發(fā)公共衛(wèi)生安全風(fēng)險。傳統(tǒng)滅菌工藝多采用固定參數(shù)（121℃、20 分鐘、重力排氣），存在滅菌死角、芽孢未全部滅活、玻璃耗材破損率高（超 5%）等問題，難以滿足 GB 19489-2008《實驗室生物安全通用要求》中 “滅菌合格率 100%、生物安全風(fēng)險可控" 的嚴(yán)苛標(biāo)準(zhǔn)。本實驗以立式高壓蒸汽滅菌器為核心設(shè)備，通過優(yōu)化關(guān)鍵參數(shù)，構(gòu)建適配不同污染廢棄物的安全高效滅菌體系，為微生物實驗室生物安全管控提供技術(shù)支撐。

一、實驗材料與方法

（一）實驗材料

污染廢棄物樣本：制備三類典型污染廢棄物 —— 含大腸桿菌（ATCC 25922）的 LB 液體培養(yǎng)基（濃度 1×10?CFU/mL）、沾有金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）的接種環(huán)、含枯草芽孢桿菌黑色變種（ATCC 9372，耐熱芽孢指標(biāo)菌）的離心管，均模擬實驗室實際污染場景制備；

生物指示劑：采用嗜熱脂肪芽孢桿菌 ATCC 7953 菌片（含菌量 1×10?-1×10?CFU / 片），作為滅菌效果核心檢測指標(biāo)（芽孢殺滅率需達 100%）；

設(shè)備與耗材：50L 立式高壓蒸汽滅菌器（支持溫度 105-134℃、壓力 0.05-0.2MPa 可調(diào)，帶數(shù)顯參數(shù)記錄功能）、生物安全柜、恒溫培養(yǎng)箱（37℃）、無菌培養(yǎng)皿、LB 固體培養(yǎng)基、玻璃離心管（10mL）、金屬接種環(huán)。

（二）實驗方案

采用正交實驗設(shè)計（3 因素 3 水平），以芽孢殺滅率（primary 指標(biāo)，目標(biāo) 100%）、耗材破損率（secondary 指標(biāo)，目標(biāo)≤1%）、滅菌能耗為評價指標(biāo)，系統(tǒng)優(yōu)化關(guān)鍵參數(shù)：

實驗因素與水平：

滅菌溫度（A）：121℃、125℃、130℃（覆蓋常規(guī)滅菌與強化滅菌溫度范圍）；

保溫時間（B）：15 分鐘、20 分鐘、25 分鐘（匹配不同污染物耐熱性）；

排氣方式（C）：重力排氣（傳統(tǒng)方式）、脈動排氣（3 次脈動）、階段排氣（升溫段 1 次 + 保溫前 2 次）；

實驗流程：

每批次將 3 類污染廢棄物與 5 片生物指示劑均勻放置于滅菌器內(nèi)（包括腔體角落、上層、下層等易形成死角的位置）；

按設(shè)定參數(shù)啟動滅菌程序，結(jié)束后取出生物指示劑，在 37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 小時，觀察是否有菌落生長（無生長則判定滅菌合格）；

統(tǒng)計芽孢殺滅率（合格生物指示劑量 / 總投放量 ×100%）與耗材破損率（破損離心管 / 總投放量 ×100%），同步記錄滅菌過程能耗數(shù)據(jù)。

二、實驗結(jié)果與優(yōu)化分析

（一）參數(shù)影響規(guī)律分析

滅菌溫度的影響：

121℃時，芽孢殺滅率僅 92%，主要因部分芽孢（如枯草芽孢桿菌黑色變種）耐熱性強，常規(guī)溫度無法全部滅活；

125℃時，芽孢殺滅率提升至 100%，且玻璃耗材無明顯破損（破損率 0.5%），溫度升高加速了蒸汽對芽孢細胞壁的破壞，同時未超出耗材耐熱閾值；

130℃時，雖能維持 100% 芽孢殺滅率，但高溫導(dǎo)致玻璃離心管熱脹冷縮應(yīng)力增大，破損率升至 3%，且能耗較 125℃增加 18%，經(jīng)濟性不佳。

保溫時間的影響：

15 分鐘保溫時，滅菌器腔體內(nèi)部溫度未全部均勻，角落位置生物指示劑出現(xiàn)陽性反應(yīng)（殺滅率 94%），滅菌不透徹；

20 分鐘保溫時，腔體溫度均勻性提升（各點位溫差≤±0.5℃），芽孢殺滅率達 100%，耗材破損率控制在 0.5%；

25 分鐘保溫時，滅菌效果無顯著提升，但能耗增加 10%，且長時間高溫易導(dǎo)致培養(yǎng)基殘渣碳化，附著于滅菌器內(nèi)壁增加清潔難度。

排氣方式的影響：

重力排氣依賴熱蒸汽自然排出冷空氣，易在腔體底部形成冷空氣滯留區(qū)（滅菌死角），芽孢殺滅率僅 95%；

階段排氣通過分階段排氣減少冷空氣殘留，殺滅率提升至 99%，但仍存在局部死角；

脈動排氣通過 3 次抽真空 - 注入蒸汽的循環(huán)，透徹排出腔體及廢棄物內(nèi)部的冷空氣，蒸汽穿透力顯著增強，芽孢殺滅率達 100%，且滅菌均勻性最好（各點位合格率一致）。

（二）最佳參數(shù)組合確定

綜合三項指標(biāo)優(yōu)化結(jié)果，確定最佳滅菌參數(shù)為：滅菌溫度 125℃、保溫時間 20 分鐘、脈動排氣方式。此參數(shù)組合下，芽孢殺滅率 100%，玻璃耗材破損率 0.5%，單批次滅菌能耗較傳統(tǒng)工藝（121℃、20 分鐘、重力排氣）降低 12%，實現(xiàn) “安全、低損、節(jié)能" 的三重目標(biāo)。

三、多場景應(yīng)用驗證

將最佳參數(shù)應(yīng)用于微生物實驗室不同類型污染廢棄物處理，連續(xù)開展 30 批次驗證實驗：

普通致病菌廢棄物（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌污染樣本）：30 批次檢測均無致病菌殘留，滅菌合格率 100%，較傳統(tǒng)工藝縮短滅菌時間 5 分鐘，適配實驗室高頻次廢棄物處理需求；

耐熱芽孢污染廢棄物（枯草芽孢桿菌黑色變種、炭疽桿菌模擬樣本）：所有生物指示劑培養(yǎng)后均無菌落生長，透徹杜絕芽孢類致病菌傳播風(fēng)險；

易破損耗材（玻璃離心管、容量瓶）：破損率穩(wěn)定在 0.3%-0.5%，較傳統(tǒng)工藝（破損率 5%）降低 90%，減少實驗耗材浪費；

生物安全合規(guī)性驗證：實驗數(shù)據(jù)（參數(shù)記錄、滅菌效果報告）可全程追溯，滿足 GB 19489-2008 對生物安全二級實驗室的滅菌記錄要求，順利通過實驗室資質(zhì)復(fù)審。

四、操作規(guī)范與注意事項

為確保優(yōu)化方案落地效果，需配套標(biāo)準(zhǔn)化操作流程：

裝載規(guī)范：廢棄物需分類裝載（固體與液體分開），裝載量不超過滅菌器腔體容積的 80%，且留有蒸汽流通間隙（避免堆疊導(dǎo)致滅菌死角）；

排氣確認(rèn)：脈動排氣階段需觀察設(shè)備壓力表，確保每次抽真空后壓力降至 0.02MPa 以下，再注入蒸汽；

冷卻處理：滅菌結(jié)束后采用自然冷卻（避免快速泄壓導(dǎo)致玻璃耗材炸裂），待壓力降至常壓、溫度低于 80℃后再開啟艙門；

定期校準(zhǔn)：每 3 個月用標(biāo)準(zhǔn)溫度計與壓力計校準(zhǔn)滅菌器，確保溫度、壓力顯示精度（偏差≤±0.5℃、±0.01MPa）。

五、結(jié)論

本實驗通過正交設(shè)計優(yōu)化立式高壓蒸汽滅菌器參數(shù)，確定 125℃、20 分鐘、脈動排氣的最佳組合，解決了傳統(tǒng)滅菌工藝存在的滅菌不透徹、耗材破損率高、能耗大等痛點。該方案可實現(xiàn)微生物實驗室各類污染廢棄物的 100% 滅菌合格，同時降低耗材損耗與能耗成本，滿足生物安全管控與合規(guī)要求。其標(biāo)準(zhǔn)化操作流程與可追溯的實驗數(shù)據(jù)，為微生物實驗室污染廢棄物處理提供了精準(zhǔn)、高效的技術(shù)參考，對提升實驗室生物安全水平具有重要實踐意義。