立式高壓蒸汽滅菌器在臨床實驗室病原微生物樣本滅菌的實驗設計與驗證

更新時間：2025-10-23 點擊次數(shù)：192

臨床實驗室病原微生物樣本（如含乙肝病毒的血清、結核分枝桿菌培養(yǎng)物、新冠病毒核酸檢測廢棄物）具有高傳染性，若滅菌不透徹，易通過氣溶膠、接觸傳播引發(fā)實驗室感染，嚴重威脅醫(yī)護人員安全，同時違反《醫(yī)療機構消毒技術規(guī)范》（WS/T 367-2012）中 “病原微生物樣本滅菌合格率 100%" 的強制要求。傳統(tǒng)滅菌工藝多采用固定參數(shù)（121℃、20 分鐘、重力排氣），缺乏針對不同病原微生物耐熱性的精準適配，存在滅菌死角、芽孢類微生物滅活不透徹等問題。本實驗通過優(yōu)化立式高壓蒸汽滅菌器關鍵參數(shù)，結合多類型病原微生物驗證，構建安全高效的滅菌體系，為臨床實驗室生物安全管控提供技術支撐。

一、實驗目的

優(yōu)化立式高壓蒸汽滅菌器針對臨床常見病原微生物（細菌、病毒、真菌）的滅菌參數(shù)，確保滅菌合格率 100%；

驗證不同參數(shù)組合下滅菌效果的穩(wěn)定性與重復性，降低耗材破損率（目標≤1%）；

建立符合生物安全二級（BSL-2）實驗室要求的標準化滅菌操作流程，滿足合規(guī)性需求。

二、實驗材料與設備

（一）實驗材料

病原微生物樣本：選取臨床實驗室典型高風險病原微生物，制備模擬污染樣本：

細菌類：結核分枝桿菌（H37Rv）菌液（濃度 1×10?CFU/mL）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）菌液（1×10?CFU/mL）、枯草芽孢桿菌黑色變種（ATCC 9372，芽孢指標菌，1×10?CFU/mL）；

病毒類：乙肝病毒（HBV）陽性血清（病毒載量 1×10?IU/mL）、新冠病毒（SARS-CoV-2）滅活前樣本（模擬樣本，含病毒核酸片段）；

真菌類：白色念珠菌（ATCC 10231）菌液（1×10?CFU/mL）；

生物指示劑：嗜熱脂肪芽孢桿菌 ATCC 7953 菌片（含菌量 1×10?-1×10?CFU / 片），作為滅菌效果核心判定指標；

耗材與試劑：一次性使用病毒采樣管、玻璃離心管（15mL）、血清管、LB 固體培養(yǎng)基、羅氏培養(yǎng)基、細胞培養(yǎng)板、無菌生理鹽水、75% 乙醇。

（二）實驗設備

50L 立式高壓蒸汽滅菌器（溫度范圍 105-134℃，壓力 0.05-0.2MPa 可調，支持重力排氣、脈動排氣模式，帶數(shù)顯參數(shù)記錄與審計追蹤功能）、生物安全柜（BSL-2 級）、恒溫培養(yǎng)箱（37℃、56℃）、生物顯微鏡、實時熒光定量 PCR 儀、細胞培養(yǎng)箱。

三、實驗設計

（一）實驗因素與水平

采用正交實驗設計（3 因素 3 水平），以病原微生物殺滅率（目標 100%）、耗材破損率（目標≤1%）為評價指標，優(yōu)化關鍵參數(shù)：

滅菌溫度（A）：121℃、125℃、130℃（覆蓋常規(guī)滅菌與強化滅菌區(qū)間，適配不同微生物耐熱性）；

保溫時間（B）：15 分鐘、20 分鐘、25 分鐘（匹配芽孢、結核分枝桿菌等頑固微生物滅活需求）；

排氣方式（C）：重力排氣（傳統(tǒng)方式）、脈動排氣（3 次抽真空 - 注蒸汽循環(huán)）、階段排氣（升溫段 1 次 + 保溫前 2 次）。

（二）實驗分組與流程

分組設置：共 9 個實驗組，每組 3 個平行樣本，同時設置空白對照組（未污染耗材）與陽性對照組（未滅菌污染樣本）；

樣本裝載：將污染樣本與生物指示劑均勻放置于滅菌器腔體（包括腔體角落、上層、下層、門邊等易形成死角的位置），裝載量不超過腔體容積的 70%，確保蒸汽流通；

滅菌操作：按設定參數(shù)啟動滅菌程序，全程記錄溫度、壓力變化曲線；

效果檢測：

細菌 / 真菌檢測：滅菌后取出樣本，梯度稀釋后接種至對應培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng) 48-72 小時，觀察菌落生長情況，計算殺滅率；

病毒檢測：HBV 樣本采用實時熒光定量 PCR 檢測病毒核酸殘留，新冠病毒模擬樣本檢測核酸片段，無擴增信號判定為滅活合格；

芽孢檢測：生物指示劑接種至 LB 培養(yǎng)基，56℃培養(yǎng) 7 天，無菌落生長判定為滅菌合格；

耗材破損統(tǒng)計：檢查玻璃離心管、血清管等耗材的破損情況，計算破損率。

四、實驗結果與分析

（一）參數(shù)優(yōu)化結果

滅菌溫度的影響：

121℃時，結核分枝桿菌殺滅率 95%，枯草芽孢桿菌殺滅率 92%，存在滅活不透徹風險；

125℃時，病原微生物殺滅率均達 100%，生物指示劑全部無菌生長，玻璃耗材破損率 0.3%；

130℃時，滅菌效果達標，但玻璃耗材破損率升至 2.8%，且能耗增加 15%，經濟性不佳。

保溫時間的影響：

15 分鐘保溫時，腔體角落樣本中枯草芽孢桿菌出現(xiàn)陽性生長（殺滅率 94%），滅菌存在死角；

20 分鐘保溫時，各點位樣本均無微生物生長，殺滅率 100%，耗材破損率 0.3%；

25 分鐘保溫時，滅菌效果無提升，但培養(yǎng)基殘渣碳化現(xiàn)象加重，增加滅菌器清潔難度。

排氣方式的影響：

重力排氣：因冷空氣滯留，腔體底部樣本殺滅率 95%（結核分枝桿菌殘留）；

階段排氣：殺滅率提升至 99%，仍有 1 組枯草芽孢桿菌樣本陽性；

脈動排氣：透徹排出冷空氣，蒸汽穿透力最佳，所有樣本殺滅率 100%，無滅菌死角。

（二）最佳參數(shù)確定

綜合實驗結果，確定臨床實驗室病原微生物樣本滅菌的最佳參數(shù)組合為：125℃滅菌溫度、20 分鐘保溫時間、脈動排氣方式。此參數(shù)下，細菌、病毒、真菌及芽孢類微生物殺滅率均達 100%，玻璃耗材破損率 0.3%，能耗較傳統(tǒng)工藝降低 10%。

五、驗證實驗與合規(guī)性評估

（一）重復性驗證

采用最佳參數(shù)連續(xù)開展 15 批次滅菌實驗，覆蓋不同類型病原微生物樣本，結果顯示：15 批次滅菌合格率均為 100%，耗材破損率穩(wěn)定在 0.2%-0.5%，重復性 RSD≤1%，滿足批量滅菌需求。

（二）臨床樣本實戰(zhàn)驗證

選取臨床實驗室實際產生的病原微生物樣本（含 HBV 血清、結核分枝桿菌培養(yǎng)物、白色念珠菌污染耗材），按最佳參數(shù)滅菌后檢測：

結核分枝桿菌培養(yǎng)物無活菌生長，HBV 樣本核酸檢測無擴增信號，白色念珠菌殺滅率 100%；

滅菌過程參數(shù)記錄完整，可追溯，符合《醫(yī)療質量管理辦法》對醫(yī)療記錄的合規(guī)要求。

（三）操作規(guī)范優(yōu)化

基于實驗結果，制定標準化操作流程：

裝載前檢查滅菌器密封圈、安全閥狀態(tài)，確保設備正常運行；

污染樣本分類裝載，液體樣本直立放置，避免泄漏；

脈動排氣階段確認每次抽真空后壓力降至 0.02MPa 以下；

滅菌后自然冷卻至壓力為 0、溫度＜80℃時再開啟艙門，避免氣溶膠溢出；

每月用標準溫度計、壓力計校準設備，確保參數(shù)精度（偏差≤±0.5℃、±0.01MPa）。

六、結論

本實驗通過正交設計優(yōu)化立式高壓蒸汽滅菌器參數(shù)，確定 125℃、20 分鐘、脈動排氣的最佳組合，可實現(xiàn)臨床實驗室細菌、病毒、真菌及芽孢類病原微生物樣本的 100% 滅菌合格，同時控制耗材破損率在 0.5% 以內。該方案兼顧滅菌效果、安全性與經濟性，配套的標準化操作流程滿足生物安全與合規(guī)要求，為臨床實驗室病原微生物樣本滅菌提供了精準、可靠的技術參考，有效降低實驗室感染風險，保障醫(yī)護人員職業(yè)安全。